基因體分析服務
DNA 甲基化定序(DNA Methylation Sequencing)
DNA 甲基化主要是指在 DNA 分子的胞嘧啶 (C) 5’ 碳原子上，形成 5-methylcytosine 甲基化修飾，這種修飾並沒有改變 DNA 序列，卻可以調控基因表現，因此是一種表觀遺傳 (epigenetic) 現象。DNA 甲基化一般發生在 CpG 雙核苷酸， CpG 聚集的區域即所謂的 CpG islands，通常出現在某些特定的區域，例如 promoter region、first exon。
DNA 甲基化在維持細胞的正常功能上扮演重要的角色，因此，DNA 甲基化的異 DNA 甲基化定序 (DNA Methylation Sequencing) - 提供基因體、蛋白質體、代謝體等整合性分析技術服務 常是引發疾病的重要機轉。以癌症為例，在正常的細胞中，CpG islands 通常處於非甲基化狀態。當細胞發生癌變，CpG islands 所在的局部區域，其甲基化異常地升高 (hypermethylation)。研究發現，抑癌基因 promoter 區CpG islands 的過度甲基化會抑制抑癌基因的表現，使細胞發生癌變的機率提高。因此，DNA 甲基化的分析成為癌症研究的重要工具，除了可以用來探討致癌機轉，也可以用來找出適當的生物標記 (biomarker)，為癌症的早期發現、分類分級、治療藥物開發、與預後評估提供新的研究方向。
- 技術平台
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DNA 甲基化定序的目的在找出甲基化異常的 CpG 位點，量化其異常的程度，比較正常與疾病狀態下的 DNA 甲基化型態。依據不同的研究需求，DNA 甲基化定序已發展出數種不同的方法。明欣生物科技備有多種技術平台，如下表所示，可依據不同研究需求，提供準確、快速且符合成本效益的 DNA 甲基化定序服務。
Methylation Profiling Strategies Bisulfite Conversion Bisulfite Sequencing 是甲基化分析的黃金標準，其利用 Sodium Bisulfite 處理 DNA，將未甲基化的胞嘧啶 (C) 轉變成尿嘧啶 (U)，而甲基化的胞嘧啶則保持不變。在隨後進行的 PCR 擴增中，尿嘧啶被替換成胸腺嘧啶 (T)。最後，對 PCR 產物進行定序，並與參考序列比較，即可檢測每一個 CpG 位點是否發生甲基化。本公司採用經過驗證的商品化試劑套組，例如QIAGEN EpiTect® Bisulfite Kits 等，確保實驗結果的有效性與再現性。 Methylated DNA Enrichment 帶有 Methyl-CpG binding domain 的蛋白質，具有黏附於甲基化 CpG 的特性，可以將帶有甲基化 CpG 的 DNA 片段分離出來，利用超高通量的次世代定序系統，對分離出來的富含甲基化 CpG 的 DNA 片段進行定序，再將定序結果與參考基因體比對，可篩選出高甲基化的區域，獲得全基因體的甲基化圖譜。此種方法適合初探性研究，比較不同樣本間的 DNA 甲基化模式，以篩選出差異化的甲基化區域。本公司採用經過驗證的商品化試劑套組，例如 Invitrogen MethylMiner™ Kit 等，以確保 enrichment 的效果。 Restriction Enzyme Digestion 利用甲基化敏感 (methylation sensitive) 限制酶以及甲基化依賴 (methylation dependent) 限制酶，對 genomic DNA 進行酶切，第一種限制酶的酶切點位於未甲基化的 CpG，如果酶切反應執行地非常完全，則只有含有甲基化 CpG的DNA 片段可以完整的保留在酶切反應的產物；反之，第二種限制酶的酶切點位於甲基化的 CpG，經過完全的酶切反應後，只有含有未甲基化 CpG 的 DNA 片段可以完整的保留在酶切反應的產物；將二種不同限制酶反應的產物分別建構成 library 後進行定序，藉由讀出的序列與參考基因體比對的結果，可以篩選出高甲基化的區域。 DNA Sequencing Platforms QIAGEN PyroMark Q24 System 本定序平台搭配 bisulfite conversion，適合應用於特定基因甲基化分析，可針對客戶提供的特定序列，進行每一個 CpG 位點甲基化狀態的定量分析。 Roche GS FLX Titanium System 此種高通量的次世代定序系統，具有可讀出較長核酸序列的優點，結合 bisulfite conversion，適合應用於多重特定基因甲基化分析。 Life Technology 5500xl SOLiD System 此種超高通量的次世代定序系統，結合 Methylated DNA enrichment 或 Restriction enzyme digestion，適合應用於全基因體甲基化圖譜分析。
- 服務項目與服務內容
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DNA 甲基化定序服務分成二類，服務內容說明如下。
特定基因甲基化分析(Gene-specific methylation analysis)-
- Assay Design
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- Design PCR & pyrosequencing primers
- Develop & optimize PCR condition
- Develop & optimize pyrosequencing condition
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- DNA Preparation
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- gDNA extraction & purification
- gDNA quality check
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- Bisulfite Treatment
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- Bisulfite treatment of gDNA using commercial kit
- Clean-up of bisulfite-treatment template
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- PCR Amplification
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- PCR amplification of bisulfite-treatment template
- Amplicons quality check
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- Pyrosequencing
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- emPCR with standard protocol(454 only)
- Sequencing on PyroMark or 454 sequencer with standard protocol
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- Analyze Data
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- Basic Data Analyze:reference sequence mapping, reads statistics(454 only)
- Methylation Quantification:methylation level at each CpG site
全基因體甲基化分析(Genome-wide methylation analysis)-
- Experiment Design
- Based on:
- Genome com-plexity
- Sample type
- Methylation profiling strate-gies
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- DNA Preparation
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- gDNA extraction & purification
- gDNA quality check
- Methylated DNA enrichment or restriction enzyme digestion
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- Construct DNA Library
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- Fragment or paired-end library construction
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- Amplify & Sequencing
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- emPCR with standard protocol
- Sequencing on SOLiD Analyzer with standard protocol
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- Analyze Data
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- Basic Data Analyze:reference genome mapping, reads statistics
- Methylation profiling
- Comparison of methylation patterns
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- Validate Result
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- validation of targeted region by bisulfite_seq
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- 服務流程
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DNA 甲基化定序的服務內容隨著多樣化的研究需求而異，考量服務成本較高且實驗方法繁複耗時，本公司採取以下的服務流程，以確保實驗結果符合客戶需求。
- 確認研究需求：請與本公司技術部門聯繫 (電話：02-26557128，Email：genomics@missionbio.com.tw)，提供您的研究需求，所需資訊如「DNA 甲基化定序服務諮詢與報價申請表」。經雙方溝通討論，確認研究需求。
- 確認委託服務方案：本公司依據確認的研究需求，提出委託服務方案，包含服務內容、分析方法、服務費用等，經客戶認可後確認之。
- DNA 樣品收集及品質檢測：客戶依據「DNA 甲基化定序樣品製備與遞送注意事項」，收集研究所需之DNA 樣品，連同填妥之「DNA 甲基化定序服務委託單」，通知本公司派員收件或快遞送達本公司實驗室 (電話：02-26557128；郵遞區號 11503，地址：台北市南港區園區街 3 號 10 樓之 1)；本公司於收到樣品後先進行品質測定，測定結果若不符品質與量的要求，將通知客戶，討論解決方案。
- 執行實驗與資料分析：樣品質量均符合要求者，依據約定的服務內容，執行各項實驗與資料分析；執行過程定期向客戶報告執行狀況。
- 交付資料及報告：提供客戶的資料及報告，包括實驗方法與步驟、原始數據、資料分析方法、資料分析結果圖表等。